二抗用于多種免疫測定中以檢測一抗的存在。這些抗體與酶、生物分子或熒光染料綴合，以允許檢測一抗。與一抗不同，二抗針對一抗的物種和同種型而產生，并用于通過在多個位置結合一抗來檢測一抗。

要成功選擇二抗，您應該考慮以下因素：

確保良好匹配– 宿主物種是產生二抗的動物，應始終與一抗宿主不同。例如，如果您使用在兔中產生的一抗，則需要在兔以外的不同物種（如山羊、驢或小鼠）中產生的抗兔二抗（圖 1）。

圖 1：二抗機制。

整個抗體還是片段？– 實際上，真正的問題是“您的一抗是單克隆抗體還是多克隆抗體？" 這兩個問題的答案通常取決于應用程序。單克隆一抗含有單一同種型的免疫球蛋白。因此，使用特異性識別該同種型的二抗至關重要。此外，單克隆抗體通常在小鼠、兔和大鼠中培養。因此，如果一抗是小鼠 IgG1，您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。抗體片段很適合免疫組織化學和免疫熒光，因為它們尺寸較小且能夠穿透組織。然而，較小的尺寸可能會限制與片段綴合的染料或酶的選擇，導致二抗的靈敏度可能低于全抗體選擇。

多克隆一抗含有多種免疫球蛋白 G 同種型的混合物。因此，為了最大限度地檢測靶標，最好使用可識別所有同種型的二抗。多克隆通常在兔、山羊、綿羊和驢中飼養，并以全抗體形式（重鏈 + 輕鏈），因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對第二宿主物種進行免疫，從而使純化的第二抗體能夠識別所有形式。例如，如果多克隆一抗是山羊 IgG，您將需要抗山羊 IgG (H+L)。然而，完整抗體可能會導致高背景和較低特異性，因為輕鏈由所有免疫球蛋白共享，這會增加交叉反應性（圖2）。

圖 2：免疫測定中完整 IgG 二抗與片段二抗的結合機制。

根據您的應用選擇結合物- 這取決于二抗如何檢測信號。例如，免疫組織化學、ELISA 和蛋白質印跡應用使用基于生物素標記的比色和化學發光檢測來放大信號并提高靈敏度，以及與辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 作用的酶反應。然而，對于免疫標記、熒光顯微鏡和流式細胞術實驗，信號是使用熒光染料（例如 Alexa Fluor）檢測的，這些染料直接與抗體綴合以放大信號和靈敏度。

親和純化與交叉吸附抗體——此步驟用于增加抗體的特異性，可以區分親和純化和交叉吸附。大多數二抗都是通過親和層析純化的，從而產生高親和力抗體。此類抗體通常用于 IHC，因為它們提供最小的非特異性結合，以及用于檢測低豐度蛋白質的蛋白質印跡。交叉吸附的二抗通常要經過額外的純化步驟，以濾除與非目標免疫球蛋白種類結合的成員。此步驟增加了它們的特異性并減少了非特異性背景。這些抗體專為免疫組織化學等特定應用而設計。