EnGen SpRY Cas9 核酸酶是來自 S. pyogenes的 Cas9 核酸酶的變體，其 PAM 作用結構域內有幾個點突變（1）。與野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在體外應用中可以在任意三核苷酸序列上游進行雙鏈切割。

EnGen® SpRY Cas9 切割靈活性的演示。A）pXba 的示意圖，顯示了限制性內切酶 BsrGI 識別位點。矩形框中包含了 BsrGI 識別序列，紅色三角形表示切割位點。B）用于靶向 pXba 中 BsrGI 位點的三個 sgRNA 序列。EnGen SpRY Cas9 和 BsrGI 的切割位點均以紅色三角指示。SpRY Cas9 非經典 PAMs 以黃色文本表示。C）在 1X NEBuffer r3.1 中，使用 10 units BsrGI 或 1µM EnGen SpRY Cas9 和上述三種 sgRNA（濃度均為1µM）消化 1µg pXba 質粒（22563 bp）。所有反應在 37°C下溫育 1 小時，然后在 80°C下溫育 5 分鐘。通過使用 Agilent gDNA ScreenTape 系統在 4200 TapeStation 儀器上進行凝膠電泳，以比較 BsrGI 和 SpRY 消化后產物 DNA 條帶。針對 pXba 質粒的 BsrGI 位點進行定點切割， BsrGI 和 SpRYCas9 切割產生了幾乎一致的條帶圖譜。使用濃度低至 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 sgRNA對 1µg pXba 質粒進行消化，結果與濃度 1 µM 的相似。未酶切的 pXba 作為對照進行電泳，但是環狀 DNA 在 gDNA ScreenTape 系統中電泳不能精確地按大小進行分離。

在 1X NEBuffer™ r3.1 中，使用 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 50 nM 的 sgRNA，在37°C下反應 1 小時，將 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII ORF 起始密碼子的下游進行線性化。在繼續 DNA 組裝之前，線性化質粒可以選擇經過柱純化或不純化。按照推薦方案，使用 NEBuilder 高保真 DNA 組裝試劑盒將編碼核定位信號（NLS）標簽的寡核苷酸插入到pVII中。通過轉化后生長的克隆數量，可以定性評估在 EnGen SpRY Cas9 消化質粒后，有多少轉化子來自未消化的質粒。雖然不是必需的，但在組裝前對線性化的 pXba 質粒進行純化可以減少背景菌落百分比。